Диапазон полезного увеличения
Чтобы мелкие детали образца были различимы в оптическом микроскопе, они должны быть достаточно контрастны и должны проецироваться на плоскость промежуточного изображения под углом, несколько большим, чем угловая разрешающая способность человеческого глаза. Если (при заданной числовой апертуре) размер увеличенного микроскопом изображения достиг разрешающей способности человеческого глаза, его дальнейшее увеличение не приводит к различению еще более мелких деталей.
Диапазон полезного увеличения комбинации объектив/окуляр определяется числовой апертурой оптической системы микроскопа. Существует минимальное увеличение, необходимое для различения мелких деталей образца, присутствующих на изображении. Это значение равняется 500-кратной величине числовой апертуре (500 x NA) и определяется уравнением:
Полезное увеличение = от 500 до 1000 × NA, где NA - числовая апертура объектива.
Соответственно, максимальное полезное увеличение изображения – это числовая апертура, умноженная на 1000, как указано в приведенном выше уравнении. Увеличение, превышающее это значение, не даст никакой дополнительной полезной информации или более точного разрешения деталей изображения и, как правило, приведет к ухудшению качества изображения. В таблице 1 перечислены распространенные комбинации объектив/окуляр, которые находятся в диапазоне полезного увеличения.
Табл.1 – Диапазон полезного увеличения (500-100 x NA)
Превышение полезного увеличения приводит к тому, что изображение ухудшается из-за явления пустого увеличения (показано на рисунке 1(b)), когда в результате увеличения окуляром или промежуточным тубусом растет лишь масштаб изображения без соответствующего роста разрешения деталей. И напротив, изображение на рисунке 1(а) было получено с помощью правильной комбинации объектива и окуляра, то есть числовая апертура была эффективно использована для достижения оптимального разрешения.
Рис.1 – Явление пустого увеличения
На самом деле, чрезмерное увеличение приводит к возникновению артефактов, эффекту гало (размытие границ изображения), которые затемняют детали образца и усложняют интерпретацию визуальных наблюдений. Микроскопические наблюдения также зависят от чувствительности человеческого глаза к интенсивности и цветовой температуре освещения, возраста наблюдателя, наличия мушек в глазу, а также от того, отдохнул ли глаз или устал.
Для визуальных наблюдений необходимо, чтобы тонкая структура образца наблюдалась под углом, несколько большим разрешающей способности человеческого глаза. При хорошем освещении в микроскопе расстояние между двумя различимыми точками образца, наблюдаемого на стандартном расстоянии 250 миллиметров, равно примерно 0,15 миллиметра, что соответствует углу остроты зрения около 2 угловых минут. Этот угол ограничен расстоянием между зрительными элементами сетчатки, расстояние между которыми составляет около пяти микрон.
Чтобы связать предел разрешения глаза и разрешающую способность объектива, можно рассмотреть две близко расположенные точки на образце. Если две точки лежат на предельном расстоянии друг от друга (в смысле разрешающей способности объектива), тогда:
r (расстояние между точками) = λ/2NA, где r – расстояние между точками, λ – длина волны освещения, NA – числовая апертура объектива.
Следующее соотношение позволяет установить, во сколько раз необходимо увеличить это расстояние, чтобы выбранные точки образца отобразились на сетчатке разделенными 0,15 миллиметра (что соответствует 2 угловым минутам):
0,15 мм = M • λ/2NA,
которое можно преобразовать в:
M = (2NA • 0.15)/λ, где M – оптимальное увеличение микроскопа.
Если предположить, что образец освещается светом из зеленого участка видимого диапазона спектра (550 нм или 0,00055 мм), уравнение может быть выражено, как:
M = (NA • 0,30)/0,00055) = (приблизительно) 500 • NA
Таким образом, минимальное увеличение, необходимое для визуального наблюдения мелких деталей образца, примерно в 500 раз больше числовой апертуры объектива. Эти выводы касаются образцов, имеющих средний контраст, поскольку детали высококонтрастных образцов, даже при меньшем расстоянии между ними, могут быть различимы при более сильном увеличении. На практике часто используются увеличения, значительно отклоняющиеся от диапазона полезного увеличения. Например, очень малое увеличение (от 1x до 4x) часто используется для топографической карты образца (например, гистологически окрашенного тонкого среза), когда желательно иметь широкое поле зрения для быстрой регистрации всех доступных характеристик образца. Во многих случаях объективы кратностью 2,5х (например, объектив T Plan EPI 2.5X) могут применяться в комбинации с широкопольными окулярами с увеличением 10х (например, окуляр CFI 10X с диоптрийной коррекцией (поле зрения 22 мм)), чтобы иметь возможность охватить площади диаметром 8 миллиметров и более.
Сильное увеличение, превышающее предел полезного увеличения, иногда применяется для более комфортного просмотра изображения. Часто к этому прибегают при наблюдении и подсчете мелких частиц или организмов при высоких числовых апертурах и кратностях увеличения. При этом жертвуют резкостью деталей образца, что обычно не мешает количественному анализу изображения.
Следует проявлять осторожность при выборе комбинации окуляр/объектив, чтобы обеспечить оптимальное увеличение деталей образца без добавления ненужных артефактов. Например, чтобы получить увеличение в 250 раз, можно выбрать окуляр с увеличением 25x и объектив с увеличением 10x. Альтернативным выбором для того же увеличения может быть 10-кратный окуляр с 25-кратным объективом (например, объектив . Поскольку объектив с 25-кратным увеличением имеет более высокую числовую апертуру (приблизительно 0,65), чем объектив с 10-кратным увеличением (приблизительно 0,25), и учитывая, что значение числовой апертуры определяет разрешающую способность объектива, очевидно, что второй вариант будет лучше. Сравнение микрофотографий, снятых этими комбинациями объектив/окуляр при одинаковом поле зрения, показало бы, что микрофотографии, полученные парой объектив 25х/окуляр 10х, отличаются большей детализацией и четкостью изображения.
...
04.07.2022
